生物检材中单乙酰吗啡、吗啡、可待因的测定 SFZ JD0107006-2010（20100407）
1、全国人民代表大会常务委员会关于司法鉴定管理问题的决定(20051001)
6、GAT1193－2014人身损害误工期、护理期、营养期评定规范（20141126）
中华人民共和国司法部司法鉴定管理局于2010年4月7日公告公布，自2010年4月7日起施行。
目 录
1范 围
2规范性引用文件
第一篇 免疫筛选法
3原 理
4试 剂
5操作方法
6结果判定
第二篇 气相色谱-质谱联用法
7原 理
8试剂和材料
9仪 器
10测定步骤
11结果计算
12方法检出限
第三篇 液相色谱一串联质谱法
13原 理
14试剂和材料
15仪 器
16测定步骤
17结果计算
18方法检出限
附录A (资料性附录) 血液、尿液、组织和毛发中单乙酞吗啡、日马啡和可待因的检出限
1范 围
本标准规定了血液、尿液、组织及毛发中单乙酞吗啡、吗啡和可待因的免疫筛选法、气相色谱一质谱联用法和液相色谱一串联质谱法测定方法。
本标准适用于血液、尿液、组织及毛发中单乙酞吗啡、吗啡和可待因的免疫筛选法、气相色谱一质谱联用法和液相色谱一串联质谱法定性定量分析。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD）
GA/T 122毒物分析名词术语
第一篇免疫筛选法
3原 理
采用高度特异性的抗原一抗体反应的免疫胶体金层析技术，通过单克隆抗体竞争结合吗啡偶联物和尿液中可能含有的吗啡，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的吗啡偶联物和被胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体。
4试 剂
吗啡尿液胶体金法试剂盒（MOP）。
5操作方法
用吸管吸取尿液检材，滴入试剂盒的样品孔中5滴（约150～200uL）3－5分钟后观察结果。
6结果判定
6.1阳性
仅质控区C出现紫红色带，而测试区T无紫红色带，提示尿液中存在吗啡类物质。
6.2阴性
质控区C及测试区T均出现紫红色带，提示尿液中无吗啡类物质或尿液中吗啡浓度在300ng/mL以下。
6.3无效
质控区C未出现紫红色带，结果无效，应重新检验。
第二篇气相色谱-质谱联用法
7原 理
单乙酞吗啡、吗啡和可待因在约pH9.2时可用氯仿：异丙醇（9：1）从生物检材中提出，用丙酸配使单乙酞吗啡、吗啡和可待因结构上的经基基团丙酞化后，用气相色谱一质谱联用仪进行检测，经与平行操作的单乙酞吗啡、吗啡或可待因对照品比较，以保留时间和特征碎片离子定性分析。
8试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
8.1单乙酞吗啡、吗啡和可待因对照品
纯度≥99%。
8.2单乙酞吗啡、吗啡和可待因对照品溶液的制备
分别精密称取对照品单乙酞吗啡、吗啡、可待因各适量，用甲醇配成lmg/mL的对照品储备溶液，置于-180C冷冻保存，保存期为1年。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备液稀释而得，储存在40C冰箱中，保存期为6个月。
8.3氯仿。
8.4异丙醇。
8.5 10%氢氧化钠溶液。
8.6丙酸酐。
8.7吡啶。
8.8硼砂缓冲液
pH9.0～9.2。
8.9甲醇。
8.10丙酮。
8.11 0.1%十二烷基磺酸钠溶液。
8.12 0.1%洗洁精溶液。
8.13浓盐酸。
8.14 0.1mo1/L盐酸溶液。
8.15MSTFA。
8.16乙腈。
9仪 器
9.1气相色谱一质谱联用仪
配有电了轰击源（EI）。
9.2分析天平
感量0.lmg。
9.3微波炉。
9.4涡旋混合器。
9.5离心机。
9.6恒温水浴锅。
9.7空气泵。
9.8移液器。
9.9具塞离心试管。
9.10冷冻研磨机。
10测定步骤
10.1样品预处理
10.1.1尿液直接提取
取尿液2mL置于1OmL具塞离心管中，用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，加入1mL硼砂缓冲液，用氯仿：异丙醇（9：1）3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约600C水浴中空气流下吹干。残留物中加入丙酸酐（50uL）、吡啶（20uL），混匀，微波炉（5OOW）衍生化3min，600C水浴中空气流下吹干，残留物用30uL甲醇溶解，取1uL进气相色谱-质谱联用仪分析。
10.1.2尿液中总吗啡或可待因的提取
取尿液2mL置于1OmL具塞离心管中，加入0.2mL浓盐酸沸水浴中水解3Omin，取出，冷却后加入1mL正丁醇，涡旋混合、离心，弃去有机层，用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，以下同10.1.1项下操作。
10.1.3血液直接提取
取血液2mL置于1OmL具塞离心管中，加入2mL硼砂缓冲液，用氯仿：异丙醇（9：1）3mL提取，以下同10.1.1项下操作。
10.1.4组织提取
将组织剪碎或匀浆，称取2g，加入2mL水，再加入0.4mL浓盐酸，沸水浴中水解3Omin取出，用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，以下同10.1.1项下操作。
10.1.5毛发提取
10.1.5.1毛发采集
贴发根处剪取毛发，发根处作标记。
10.1.5.2毛发洗涤
毛发样品依次用0.1%十二烷基磺酸钠溶液、0.1%洗洁精溶液、水和丙酮振荡洗涤一次，晾干后剪成约1mm段，供检。
10.1.5.3毛发的提取、净化
称取5Omg毛发，加1mLO.lmol/L盐酸溶液浸润，450C水浴水解12～15小时或超声1小时（针对磨碎的头发），取出后用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，加入1mL硼砂缓冲液，用氯仿：异丙醇（9：1）3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约600C水浴中空气流下吹干。残留物中加入MSTFA（25uL）、乙腈（25uL），混匀，微波炉（5OOW）衍生化3min，冷却后取1uL进气相色谱一质谱联用仪分析。
10.2样品测定
10.2.1气相色谱一质谱参考条件
a）色谱柱：HP-1MS毛细管柱（30mx0.25mmx0.25um）或相当者；
b）柱温：1000C保持1.5min，以250C/min程序升温至2800C，保持15min；
c）载气：氦气，纯度≥99.999%，流速：1.OmL/min ；
d）进样口温度：2500C ；
e）进样量：1uL；
幻电了轰击源：70eV；
g）四极杆温度：1500C；
h）离子源温度：2300C；
i）接口温度：2800C；
j）检测方式：SIM。
每种化合物分别选择3个特征碎片离子。单乙酞吗啡、吗啡、可待因的保留时间与特征碎片离子见表1。
表1 单乙酞吗啡、吗啡、可待因的色谱峰保留时间与碎片离子
10.2.2定性测定
进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差小于2%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子相对丰度比与添加对照品的离子相对丰度比之相对误差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在这种化合物。
表2 相对离子丰度比的最大允许相对误差（%）
10.2.3定量测定
采用外标一校准曲线法或单点法定量。用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系列校准样品，以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线，并且保证所测样品中目标物的浓度值在其线性范围内。当检材中目标物浓度在空白检材中添加目标物浓度的±50%以内时，可采用单点校准法来计算目标化合物的浓度。
10.3平行试验
样品应按以上步骤同时平行测定两份。
平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算，双样相对相差不得超过20 （腐败检材不超过30%）。双样相对相差按式（1）计算：
式中：
C1、C2——两份样品平行定量测定的结果；
C——两份样品平行定量测定结果的平均值（C1+C2）/2。
10.4空白试验
除以相同基质空白替代检材外，均按上述步骤进行。
11结果计算
以外标一校准曲线法或按式（2）计算被测样品中单乙酞吗啡、吗啡或可待因浓度：
式中：
C——检材中目标物的浓度（ug/mL或ug/g）
A1——检材中目标物的峰面积
A2——空白检材中添加目标物的峰面积
W——空白检材中目标物的添加量（ug）
W1——检材量（mL或g）
12方法检出限
血液、尿液、组织和毛发中单乙酞吗啡、吗啡和可待因的检出限见附录A。
第三篇液相色谱一串联质谱法
13原 理
单乙酞吗啡、吗啡、可待因在约pH9.2时可用氯仿：异丙醇（9：1）从生物检材中提出，提取后的样品用液相色谱一串联质谱法的多反应监测模式进行检测，经与平行操作的单乙酞吗啡、吗啡和可待因对照品比较，以保留时间和两对母离子/子离子对进行定性分析。
14试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
14.1单乙酞吗啡、吗啡、可待因对照品及溶液的制备同8.1及8.2。
14.2氯仿。
14.3异丙醇。
14.4丙酮。
14.5硼砂缓冲液
pH9.0-9.2。
14.6浓盐酸。
14.7 O.lmol/L盐酸溶液。
14.8 10%氢氧化钠溶液。
14.9 0.1%十二烷基磺酸钠溶液。
14.10 0.1%洗洁精溶液。
14.11乙腈
色谱纯。
14.12甲酸
优级纯。
14.13乙酸胺
色谱纯。
14.14流动相缓冲液
20mmo1/L乙酸铰和0.1%甲酸缓冲液：分别称取1.54g乙酸铰和1.84g甲酸置于1OOOmL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值约为4。
15仪 器
15.1液相色谱一串联质谱仪
配有电喷雾离子源（ESI）。
15.2分析天平
感量0.1mg。
15.3涡旋混合器。
15.4离心机。
15.5恒温水浴锅。
15.6空气泵。
15.7移液器。
15.8具塞离心试管。
15.9冷冻研磨机。
16测定步骤
16.1样品预处理
16.1.1尿液提取
取尿液2mL置于1OmL具塞离心管中，用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，加入1mL硼砂缓冲液，用氯仿：异丙醇（9：1）3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约600C水浴中空气流下吹干。残留物中加入100uL乙腈：流动相缓冲液（70：30）进行溶解，取5uL进LC-MS/MS。
16.1.2血液提取
取血液2mL置于1OmL具塞离心管中，加入2mL硼砂缓冲液，用氯仿：异丙醇（9：1）3mL提取，以下同15.1.1项下操作。
16.1.3组织提取
将组织剪碎或匀浆，称取2g，加入2mL水，再加入0.4mL浓盐酸沸水浴中水解3Omin取出，用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，以下同15.1.1项下操作。
16.1.4毛发提取
称取5Omg毛发，加1mL O.lmol/L盐酸溶液浸润，450C水浴水解12～15小时或超声1小时（针对磨碎的头发），取出后用10%氢氧化钠溶液调至pH9.0～9.2，加入1mL硼砂缓冲液，以下同15.1.1项下操作。
16.2样品测定
16.2.1液相色谱一串联质谱参考条件
a）色谱柱：Allure PFP Propyl 100mmx2.1mmx5um或相当者，前接保护柱；
b）柱温：室温；
c）流动相：V（乙腈）：V（缓冲液）-70：30；
d）流速：200uL/min；
e）进样量：5uL；
f）扫描方式：正离子扫描（ESI+） ；
g）检测方式：多反应监测（MRM）；
h）离子喷雾电压：5500 V；
i）离子源温度：5000C ；
j）每个化合物分别选择2对母离子/子离子对作为定性离子对，以第一对离子对作为定量离子对。其定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP），碰撞能量（CE）和保留时间（tR）见表3。
表3单乙酞吗啡、吗啡和可待因的定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP），碰撞能量（CE）和保留时间（tR）
16.2.2定性测定
进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差小于2%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现所选择的离子对，而且所选择的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比之相对误差不超过表4规定的范围，则可判断样品中存在这种化合物。
表4 相对离子对丰度比的最大允许相对误差（%）
16.2.3定量测定
采用外标一校准曲线法或单点法定量。用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系列校准样品，以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线，并且保证所测样品中目标物的浓度值在其线性范围内。当检材中目标物浓度在空白检材中添加目标物浓度的±50%以内时，可采用单点校准法来计算目标化合物的浓度。
16.3平行试验
样品应按以上步骤同时平行测定两份。
平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算，双样相对相差不得超过20%（腐败检材不超过30%）。双样相对相差按式（1）计算：
式中：
C1、C2——两份样品平行定量测定的结果；
C——两份样品平行定量测定结果的平均值（C1+C2） /2。
16.4空白试验
除以相同基质空白替代检材外，均按上述步骤进行。
17结果计算
以外标一校准曲线法或按式（2）计算被测样品中单乙酞吗啡、吗啡或可待因浓度：
式中：
C——检材中目标物的浓度（ug/mL或ug/g）
A1——检材中目标物的峰面积
A2——空白检材中添加目标物的峰面积
W——空白检材中目标物的添加量（ug）
W1——检材量（mL或g）
18方法检出限
血液、尿液、组织和毛发中单乙酞吗啡、吗啡和可待因的检出限见附录A。
·附录A
(资料性附录) 血液、尿液、组织和毛发中
单乙酞吗啡、日马啡和可待因的检出限
血液、尿液、组织和毛发中单乙酞吗啡、吗啡和可待因的检出限见表A。
表A 生物检材中单乙酞吗啡、吗啡和可待因的检出限
戴卫祥 律师
戴卫祥，辽宁东亚律师事务所律师、合伙人，专注于司法鉴定业务。2001年开始从事法律工作，具有丰富的法律理论和实践经验，尤其对刑事鉴定、伤残鉴定、机动车交通事故鉴定、痕迹物证鉴定、建设工程鉴定、消防鉴定等具有丰富的办案经验，积累了大量的成功案例。
戴卫祥律师联系方式
电话：13940919059
微信号码：dailvshi8
大连市中山区鲁迅路58号天通金融大厦1616
司法鉴定律师
长按识别二维码关注